300kd hålfiberultrafiltrering: analys av en hög-effektiv koncentrations- och reningsprocess för mul-- och-o/a-virus för mul- och klövsjuka
Sep 03, 2026| Introduktion
Mul--och-mul- och klövsjuka (FMD) är en akut, febril och mycket smittsam djursjukdom som orsakas av mul--}- och-munsjukevirus (FMDV). Detta virus drabbar klövdjur, med över 70 mottagliga arter. Det sprider sig snabbt och har en hög sjuklighet, vilket vanligtvis drabbar större boskap som grisar, får och nötkreatur, där förekomsten kan nå 100 %. FMDV tillhör släktetFot--och-munvirusav familjen MicroRNAviridae. Partiklarna är sfäriska, cirka 27-30 nm i diameter, med en sedimenteringskoefficient på 146S för intakta viruspartiklar. För närvarande finns olika MKS-vacciner tillgängliga, inklusive försvagade levande virusvacciner, levande virusvektorvacciner, inaktiverade vacciner, nukleinsyravacciner, syntetiska peptidvacciner och subenhetsvacciner. Inaktiverade MKS-vacciner har i allmänhet färre biverkningar hos djur, och multivalenta vacciner ger bättre immuniseringseffekt, vilket gör dem till stöttepelaren i förebyggande av MKS i Kina.
Tangential Flow Ultrafiltration
För närvarande är ultrafiltrering med tangentiellt flöde en vanlig renings- och koncentrationsmetod i stor-produktion av multivalenta inaktiverade vacciner för mul-och-klolsjuka. Denna metod uppnår inte bara den önskade koncentrationsfaktorn utan tar också bort en stor mängd främmande föroreningar. Tangentiellt flödesultrafiltrering används huvudsakligen för rening, koncentrering och filtrering (avsaltning och buffertbyte). Dessutom kan den också användas för klarning av fermenteringsbuljong eller cellodlingsmedium med tangentiellt flödesmikrofiltrering, vilket ersätter centrifugering eller primär klarning.
Vid konventionell vertikal filtrering tenderar stora molekyler att aggregera på membranytan, vilket täpper till filtret. Tangentiell flödesfiltrering tillåter emellertid att flödet fortskrider parallellt med membranet, vilket undviker detta igensättningsproblem. Under tangentiell flödesfiltrering kallas lösningsmedlet och ämnen som är mindre än membranets porstorlek som tränger genom membranet för permeatet, medan ämnen större än porstorleken behålls som koncentratet. I kombination med optimerade tvätt- och filtreringsprocesser kan separation och rening av molekyler av varierande storlek uppnås. Denna teknik erbjuder fördelar som låg kostnad, milda driftsförhållanden, bekväm rengöring och utbyte, hög membranpermeatflödeshastighet och enkel användning, vilket gör den särskilt lämplig för stor-koncentrering och rening av bioaktiva ämnen.
Material och metoder
Hålfiberkolumn:Molekylviktsgräns på 300 kd, membranarea på 1600 cm².
Material:5,6 L vardera av supernatanten från FMDV typ O och typ A efter centrifugering och klarning.
Processparametrar:Under ultrafiltreringskoncentrering justerades skjuvkraften till ungefär 3000-1 och TMP reglerades till att inte vara högre än 10 psi. När koncentrationsfaktorn närmade sig 11 gånger tvättades provet med 6CV buffertlösning. Efter tvättning infördes steril luft i inloppsröret och allt koncentrerat prov i slangen injicerades i provkoncentrationsflaskan. Därefter tillsattes steril PBS för att skölja slangen tills den slutliga volymen av den koncentrerade vätskan var 500 ml, vilket förbättrade den totala återvinningshastigheten.
Resultat och diskussion
När det gäller initial virusrening uppnår ultrafiltreringskoncentrationen en borttagningshastighet på över 90 % för föroreningar som proteiner som inte innehåller virus. Volymmässigt kan den uppnå höga koncentrationer på 10-50 gånger, vilket ger starkt stöd för efterföljande rening. En ihålig fiberkolonn med en molekylviktsgräns på 300 kd väljs. Denna porstorlek, samtidigt som den behåller över 85 % av viruset, kan ta bort över 90 % av föroreningsproteinerna. Membranytan är 1600 cm², och genomströmningen är 2-5 ml/cm², vilket gör att ultrafiltreringskoncentrationen kan slutföras inom en effektiv tid (inom 2 timmar). Detaljerade ultrafiltreringskoncentrations- och reningsdata visas i tabell 1.
Tabell 1. Resultat av total upptäckt av mul--- och-mul--antigener (typ O och A)
| Exempelnamn | Flytande foder | Volym (ml) | 146S-innehåll (ug/ml) | 146S återhämtningsfrekvens (%) | Proteinkoncentration (ug/ml) | Proteinborttagningshastighet (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| O-typ | Originallösning | 5600 | 2.53 | 87.94 | 5040 | 94.38 |
| O-typ | Koncentrera | 500 | 24.92 | 87.94 | 3170 | 94.38 |
| En-typ | Originallösning | 5600 | 3.37 | 94.80 | 5980 | 93.55 |
| En-typ | Koncentrera | 500 | 35.78 | 94.80 | 4318 | 93.55 |
Reningsmetodöverväganden
För närvarande finns det olika reningsmetoder, men även med samma metod för samma antigen är reningseffekten ofta otillfredsställande av många anledningar, inklusive antigenkarakterisering och processparametrar. Till exempel kan förändringar i uppströms molekylär design eller fermentationsodlingssystem förändra den virala molekylära strukturen, vilket leder till otillfredsställande reningsresultat. Olämpliga klarningsmetoder kan öka råvarukostnaderna eller mängden heterologt protein, vilket ökar trycket på nedströmsrening. Felaktig ultrafiltreringskoncentration, såsom olika porstorlekar för ultrafiltreringsmembran, koncentrations- och elueringsfaktorer, inloppsflöden, filtreringshastigheter och TMP, kan resultera i låga antigenåtervinningshastigheter. Omfattande praxis visar att dålig rening kan orsaka betydande biverkningar hos djur efter immunisering, vilket kan leda till döden.
Slutsats:Denna studie visar att, i tangentiella flödesprocesser, genom att välja lämplig membranporstorlek (300 kd), tvättförhållande, inloppsflöde och TMP, kan både hög återvinningshastighet och maximalt avlägsnande av föroreningar säkerställas.