TFF-tangentialflödesfiltrering kombinerat med ultracentrifugering för effektiv små extracellulära vesikelförberedelser

Små extracellulära vesiklar (sEV) är vesiklar i nanoskala som utsöndras av celler som innehåller nukleinsyror, proteiner, små molekyler och andra komponenter och spelar en viktig roll i intercellulär kommunikation. Små extracellulära vesiklar av exosom-typ har stora likheter med sina moderceller. Jämfört med konstgjorda nanopartiklar uppvisar de lägre immunclearancehastigheter och lägre cytotoxicitet, vilket gör dem till lovande kandidater som nyain vivo läkemedelstillförselvehiklar. Nästan alla typer av celler kan utsöndra dessa vesiklar, och forskning om deras tillämpning som läkemedelsbärare går gradvis från laboratoriet till kliniska tillämpningar. Dock,storskalig-produktion är fortfarande en stor flaskhals.

 

Aktuella metoder för extracellulär vesikelisolering

Nuvarande extracellulära vesikelisoleringsmetoder inkluderarultracentrifugering, densitetsgradientcentrifugering, storleks-exklusionskromatografi (SEC) och polyetylenglykol (PEG) utfällning.

PEG-utfällning ger högt utbyte och enkel drift, men det är associerat med betydande kontaminering av oönskade proteiner. Densitetsgradientcentrifugering och storleks-uteslutningskromatografi kan ge produkter med hög-renhet, men deras effektivitet är relativt låg och processerna är tidskrävande-. Ultracentrifugering används i stor utsträckning, men dess bearbetningsvolym begränsas av centrifugkapaciteten, vilket gör det svårt att skala upp.

 

Tillämpning av Tangential Flow Filtrering för sEV Separation

Tangential flow filtration (TFF) har redan tillämpats för separation av nanopartiklar som liposomer och lentivirala vektorer. I TFF flyter matningen tangentiellt över membranytan, vilket hjälper till att minska membrannedsmutsning och gör processen lättare att skala upp.

Eftersom små extracellulära vesiklar i allmänhet sträcker sig från30–200 nmi diameter, a0,45 μm membrankassettkan väljas i TFF-systemet för att ta bort större proteiner och vesikler, medan en300 kDa membrankassettkan användas för att ta bort småmolekylära-proteiner och koncentrera de små extracellulära vesiklar som finns i odlingsmediet.

 

Karakterisering av råmaterialet efter TFF-separation

Nanopartikelspårningsanalys (NTA) visade att partikeldiametrarna huvudsakligen var fördelade inom området för0–250 nm.

 

 

Emellertid avslöjade transmissionselektronmikroskopi (TEM) en stor mängd kontaminerande protein, medan inga extracellulära vesiklar observerades. Dessa resultat indikerade att ett ytterligare nedströms reningssteg krävdes för att ytterligare rena de extracellulära vesiklarna.

 

Karakterisering av TFF-koncentratet efter 100 kDa ultrafiltrering

TFF-koncentratet bearbetades ytterligare med användning av en100 kDa ultrafiltreringsrör.

NTA visade att partikeldiametrarna i koncentraten som erhölls efter en och två omgångar av ultrafiltrering huvudsakligen höll sig inom intervallet för0–250 nm. Utförande av ultrafiltrering två gånger resulterade emellertid i en signifikant minskning av antalet erhållna partiklar.

TEM-analys visade att inga -vesikelliknande strukturer observerades i vare sig en- eller två- ultrafiltreringskoncentrat, medan en betydande mängd kontaminerande protein fanns kvar.

Därför,100 kDa ultrafiltrering kunde inte användas effektivt för att rena odlingsmediet efter TFF-koncentration.

 

 

Karakterisering av TFF-koncentratet renat genom ultracentrifugering

NTA visade att partikeldiametrarna för de renade produkterna huvudsakligen fördelades inom intervallet för0–250 nm.

Viktigt är att TEM tydligt avslöjade -vesikelliknande strukturer över olika synfält. Dessa resultat visade att efter koncentrering av odlingsmediet med TFF,ultracentrifugering kan därefter användas för ytterligare separation och rening av extracellulära vesiklar.

 

 

Karakterisering av sEVs isolerade från mesenkymala stamcellskonditionerade medium med användning av TFF kombinerat med ultracentrifugering

NTA visade att partikeldiametrarna för de renade produkterna huvudsakligen fördelades inom intervallet för0–250 nm.

Vesikelliknande strukturer- observerades av TEM. Western blot-analys visade positivt uttryck av de extracellulära vesikel-associerade proteinernaCD9, CD63 och ALIXi de renade extracellulära vesiklarna.

Dessa resultat bekräftade att de renade små extracellulära vesiklarna innehöll exosomer, vilket indikerar att denna metod också kan användas förexosom isolering och extraktion.

 

 

Slutsats: TFF kombinerat med ultracentrifugering för hög-sEV-förberedelse

Studien visade detEnbart TFF-koncentrationresulterade i en produkt innehållande en avsevärd mängd kontaminerande proteiner och var därför otillräcklig för att erhålla kvalificerade extracellulära vesiklar.

På samma sätt använder man en100 kDa ultrafiltreringsrör för sekundär reninggav inte effektivt intakta vesikelstrukturer.

Genom att kombinera TFF-koncentration med efterföljande ultracentrifugeringsrening kan fördelarna med båda teknikerna integreras för att erhållasmå extracellulära vesikelprodukter av hög-kvalitet.

Jämfört med enbart konventionell ultracentrifugering kan den kombinerade processen effektivtminska den totala bearbetningstiden och förbättra separationseffektiviteten.

I detta arbetsflöde,TFF möjliggör snabb anrikning av-volymprover, som tar itu med begränsningen av konventionell ultracentrifugering vid bearbetning av stora provvolymer. Ultracentrifugering utför sedan djuprening för att avlägsna sam-koncentrerade proteinföroreningar samtidigt som det hjälper till att bibehålla renheten och integriteten hos vesiklarna.

Dessutom kräver processen inte tillägg avexogena kemiska utfällningsreagenser, hjälper till att bevara den biologiska aktiviteten hos vesiklarna i största möjliga utsträckning.

Ur industriell översättnings perspektiv har denna process betydandeskala upp-potentialenoch kan hjälpa till att ta itu med utmaningarna i samband med stor-produktion av extracellulära vesiklar förläkemedelsleverans, regenerativ medicin och relaterad produktutveckling. Det ger också en solid experimentell grund för efterföljande processoptimering och pilot-tillverkning.

 

Hänvisning

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Upprättande av en metod för separering av små extracellulära vesiklar genom filtrering av tangentiellt flöde kombinerat med ultracentrifugering. Chinese Journal of Biologicals, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.