Experimentella tillämpningar och felsökningslösningar för ultrafiltreringscentrifugalrör

Ett ultrafiltreringscentrifugrör är en vanlig membranfiltreringsanordning i laboratoriet. Dess kärnkomponent är ett ultrafiltreringsmembran med en specifik molekylviktsgräns. Vanliga ultrafiltreringsmembranmaterial inkluderar polyetersulfon (PES) och regenererad cellulosa (RC). Arbetsprincipen för ultrafiltreringscentrifugalröret är att använda centrifugalkraft och molekylär -storlek-baserad siktning för att driva små molekyler genom ultrafiltreringsmembranet, vilket möjliggör snabb koncentration, avsaltning, buffertbyte eller rening och separation av biomakromolekyler som proteiner och nukleinsyror.

 

MWCO Val

Protein	Rekommenderad MWCO	Rekommenderad centrifugeringstid
6–20 kDa	3 kDa	40 min
20–30 kDa	5 kDa	30 min
30–60 kDa	10 kDa	20 min
60–100 kDa	30 kDa	20 min
100–200 kDa	50 kDa	15 min
200–600 kDa	100 kDa	15 min
>600 kDa	300 kDa	15 min
Enkel- eller dubbel-nukleinsyramolekyler	Rekommenderad MWCO	Rekommenderad centrifugeringstid
137–1159 bp	30 kDa / 100 kDa	10 min (fast-vinkelrotor, 5000 × g)
Nanopärlor	Rekommenderad MWCO	Rekommenderad centrifugeringstid
1,5–2 nm	3 kDa	40 min
2–3 nm	5 kDa	30 min
3–5 nm	10 kDa	20 min
5–7 nm	30 kDa	20 min
7–10 nm	50 kDa	15 min
10–30 nm	100 kDa	15 min
>30 nm	300 kDa	15 min

 

För proteiner rekommenderas det att välja ett membran MWCO som är 2–6 gånger lägre än molekylvikten för målproteinet. Om flödeshastighet också beaktas, rekommenderas ett membran MWCO under detta 2×–6× intervall.

 

Application Case (DNA från Shed Cells)

För den konventionella metoden skars en bit gasväv på 2,5 cm × 2 cm, lyserades i ett system med liten -volym och renades direkt med hjälp av instrumentet. För koncentrationsmetoden fördubblades provtagningsytan för gasväv. Efter lys överfördes uppslutningssupernatanten till ett 100 kDa ultrafiltreringscentrifugalrör, koncentrerades genom centrifugering vid 10 000 r/min, utvanns genom inverterad centrifugering och utsattes sedan för DNA-extraktion med användning av ett helt automatiserat nukleinsyrareningsinstrument. Elueringsvolymen var enhetligt inställd på 40 μL för att säkerställa att de initiala cellnivåerna i de två grupperna var i huvudsak jämförbara.

 

Kvantitativ testning visade att den genomsnittliga DNA-koncentrationen var 0,099 ± 0,041 ng/μL för den konventionella metoden och 0,193 ± 0,068 ng/μL för koncentrationsmetoden. Skillnaden mellan de två grupperna var statistiskt signifikant (P < 0,01). Det totala DNA-utbytet som erhölls med koncentrationsmetoden var 1,95 gånger det för den konventionella metoden, vilket visar att ultrafiltreringskoncentrationssteget nästan inte orsakade någon förlust av totalt DNA. Ct-värdena för de två grupperna var 27,64 ± 0,39 respektive 27,58 ± 0,40, med P > 0,01, vilket indikerar att ultrafiltreringsbehandling inte introducerade PCR-amplifieringsinhibitorer eller stör efterföljande amplifieringsreaktioner.

 

För STR-genotypning definierades en komplett genotyp av kompletta band vid varje lokus och en medeltopphöjd större än eller lika med 200 RFU. Bland 20 parallella prover gav den konventionella metoden fullständiga genotyper för endast 14 prover, medan koncentrationsmetoden uppnådde fullständig STR-genotypning för alla 20 prover, vilket signifikant förbättrade den effektiva genotypningsdetekteringshastigheten för spårkontaktprover.

Guidling Technology ultrafiltreringscentrifugalrör har enkel drift, höga koncentrationsfaktorer och höga provåtervinningshastigheter och används ofta inom biokemi, molekylärbiologi och andra områden. Återvinningsgraden för Guidling Technology ultrafiltreringscentrifugalrör varierar beroende på materialet som bearbetas och kan i allmänhet överstiga 90 %.

 

Vanlig felsökning

Problem	Möjlig orsak	Lösning
Nederbörd sker under koncentration	Koncentrationen är för snabb	Minska centrifugeringshastigheten
		Använd ett ultrafiltreringsrör med en högre molekylviktsgräns
		Pipettera upp och ner i centrifugalröret och centrifugera sedan igen
	Över-koncentration	Det rekommenderas att den slutliga proteinkoncentrationen efter koncentration inte överstiger 20 mg/ml
Vatten kan inte filtreras igenom	Ultrafiltreringsmembranet är helt torrt och membranytan blir svagt hydrofob	Fukta membranet med ett lösningsmedel med låg-ytspänning- (utför t.ex. initial centrifugering med 20 % etanol i vatten)
Inget målprotein finns i koncentratet	Den initiala proteinprovkoncentrationen är för låg (< 25 μg/mL)	Om provkoncentrationen är låg och volymen är stor, ladda provet upprepade gånger och centrifugera
	Felaktigt val av membran MWCO	Membranets MWCO är i allmänhet mindre än 2 gånger molekylvikten för målproteinet eller mer
	Centrifugalkraften ligger utanför det specificerade området	Rekommenderad centrifugalkraft: 3000–5000 × g
	Målprotein har fallit ut	Justera målproteinkoncentrationen i koncentratet (justera koncentrationsfaktorn)
		Kontrollera temperaturen och pH
		Använd tillsatser
		Justera jonstyrkan
Interferens uppstår under nedströmsanalys av koncentrerat protein	Ultrafiltreringsmembranet innehåller spårmängder av glycerol	För-skölj ultrafiltreringsröret med buffert och renat vatten. Om interferensen kvarstår, rengör med 0,1 M NaOH, skölj sedan med renat vatten och centrifugera
RNase-kontamination	Ultrafiltreringsröret är inte garanterat RNase-fritt	Det rekommenderas att blötlägga i 0,1 % DEPC vid 37 grader i 2 timmar för att helt inaktivera RNase; återstående DEPC kan avlägsnas genom att skölja med renat vatten
Endotoxinkontamination	De medföljande ultrafiltreringsrören har inte genomgått endotoxin-borttagningsbehandling, och endotoxiner finns i stor utsträckning i naturen	Före experimentet, för-rengör du med 0,5 M NaOH, följt av sköljning med renat vatten för att ta bort de flesta endotoxiner